Cos'è

Stato di salute degli embrioni

Circa il 50% degli embrioni prodotti nella ICSI o FIVET presenta anomalie genetico-cromosomiche e pertanto tende a non impiantare nell’utero o in alcuni casi a dare origine a feti anomali con conseguente aborto spontaneo entro il 1° trimestre. Questo dato si riscontra anche in donne giovani, e riflette la produzione di embrioni difettosi che si riscontra anche in natura.

Ogni volta che un ciclo di fecondazione in provetta (ICSI e FIVET) produce più di un embrione, occorre scegliere quale/i trasferire in utero.

Perchè lo screening pre-impianto

Il concetto fondamentale alla base della possibile utilità di determinare lo stato di salute dell'embrione è il seguente: è impossibile distinguere, sulla base della forma (morfologia) e della cinetica di crescita (velocità di sviluppo) degli embrioni, quale degli embrioni generati in provetta sia sano per tutti i cromosomi.

Ne deriva che quando si trasferiscono embrioni su base morfologica o cinetica di crescita, la possibilità di trasferire embrioni "belli" e "veloci", ma completamente anomali sul piano cromosomico è elevata.

E' per questa ragione che metodiche presentate come innovative (esempio l'utilizzo di un macchinario chiamato Embryoscope, che verifica la velocità di crescita degli embrioni), sono del tutto inutili a migliorare i risultati, che dipendono dall'assetto cromosomico degli embrioni trasferiti.

Un embrione cromosomicamente sano impianterà in oltre il 70% dei casi, mentre un embrione anomalo non impianterà in oltre il 90% dei casi.

Nei trattamenti standard di FIVET ed ICSI praticati nella totalità dei centri italiani, la scelta è determinata dall’aspetto degli embrioni e dalla loro capacità di sviluppo durante i giorni di crescita in laboratorio: questi parametri, tuttavia, hanno una limitata capacità di determinare lo stato di salute dell’embrione.

La valutazione della salute dell’embrione consente, attraverso lo screening genetico pre-impianto (PGS), cioè effettuata prima del trasferimento in utero, di basare la decisione su un parametro di certezza, cioè l’assetto genetico dell’embrione. In questo modo, si possono trasferire solo gli embrioni sani.

Nel nostro Centro, la valutazione della salute dell’embrione consiste nel PGS effettuato allo stadio di blastocisti.

Al 5° giorno di sviluppo embrionale, viene effettuata una biopsia del tessuto (trofoblasto, trofoectoderma) che circonda l’embrione e che darà origine alla placenta, da cui vengono rimosse delicatamente circa 3-5 cellule. La massa cellulare interna al polo embrionario, che dà origine all’embrione non viene quindi toccata e pertanto non viene compromessa la funzionalità dell’embrione.

Le cellule prelevate vengono inviate al laboratorio di genetica, per la diagnosi, mentre la blastocisti prosegue la sua crescita in laboratorio, fino al giorno dopo, in cui viene trasferita, oppure viene congelata, se c’è indicazione.

In poche ore, il laboratorio è in grado di determinare lo stato di salute dell’embrione, escludendo per esempio la sindrome di Down con un elevato grado di accuratezza. Pertanto, solo gli embrioni sani vengono trasferiti in utero, mentre quelli malati vengono congelati, secondo le indicazioni della legge italiana, che impedisce la soppressione di embrioni seppur malati e non destinati al transfer embrionale.

Nella Legge 40 del 2004 è presente la possibilità per la coppia di addivenire alla conoscenza sullo stato di salute dell’embrione: l’art. 14 comma 5 infatti stabilisce che “ i soggetti di cui all’art. 5 sono informati sul numero, e su loro richiesta, sullo stato di salute degli embrioni prodotti e da trasferire nell’utero”. I soggetti richiamati sono coloro che posseggono i requisiti soggettivi che consentono l’accesso alla procreazione medicalmente assistita e cioè “le coppie di maggiorenni di sesso diverso, coniugate o conviventi, in età potenzialmente fertile, entrambi viventi” (art. 5 della Legge 40/2004).

Quando effettuare lo screening pre-impianto

ll Gruppo Donnamed effettua l'analisi nei seguenti casi:

•     richiesta della coppia che ha il diritto, sancito dalle normative in atto, di richiedere la conoscenza dello stato di salute dell'embrione
•     età materna avanzata (oltre 35 anni)
•     ripetuti fallimenti dell'impianto in almeno 2 cicli di fecondazione in vitro precedenti
•     anomalie gravi del seme
•     poliabortività

Nei casi in cui mancano queste indicazioni, il Gruppo Donnamed si rifà alla letteratura internazionale.

Utilità dello screening genetico pre-impianto

L'utilità dello screening genetico pre-impianto, in generale, è controversa in letteratura. In questo senso, occorre distinguere 2 metodiche:

1. Biopsia e analisi al 3° giorno di sviluppo embrionale mediante FISH
2. Biopsia e analisi al 5° giorno di sviluppo embrionale (allo stadio di blastocisti) mediante array CGH.

Biopsia e analisi al 3° giorno mediante FISH

FISH è un acronimo che indica la Fluorescent in situ hybridization (ibridazione fluorescente in situ). E' una tecnica che può essere utilizzata per rilevare anomalie nei cromosomi. Essa utilizza delle sonde a fluorescenza che si legano in modo estremamente selettivo ad alcune specifiche regioni del cromosoma.  Essendo la sonda fluorescente, può essere identificata con uno speciale microscopio a fluorescenza.

Tecnica: al 3° giorno di sviluppo embrionale viene prelevato con una biopsia microchirurgica un blastomero, cioè una delle cellule totipotenti che costituiscono l'embrione. Su questa cellule, viene applicata la tecnica FISH per determinare se i cromosomi hanno un assetto corretto o anomalo.

Il principio su cui si basa questa metodica è che tutte le cellule dell'embrione siano uguali. In realtà, esiste un certo grado di variabilità tra le cellule che costituiscono l'embrione al giorno 3, ossia la cellula analizzata può essere normale per tutti i cromosomi, ma le altre anomale, o viceversa (mosaicismo).

Altro limite della metodica è nel fatto che la FISH può analizzare, per ragioni tecniche, solo alcuni cromosomi (5-12 al massimo). Ne deriva che gli altri cromosomi, quelli non analizzati, possano ancora essere anomali e che un embrione diagnosticato come sano possa ancora essere anomalo.

Questo approccio allo screening genetico pre-impianto ha dimostrato (in ben 11 studi pubblicati e in una metanalisi che li analizza insieme) di non possedere alcun vantaggio.

Biopsia e analisi al 5° giorno di sviluppo embrionale (allo stadio di blastocisti) mediante array CGH

E' la tecnica utilizzata dal nostro Gruppo.

Array CGH è un acronimo che indica la array-comparative genomic hybridization (array-ibridazione genomica comparativa). E' una tecnica in cui il messaggio genetico (DNA) del campione da studiare viene legato a una sonda fluorescente diversa da quella usata per "marcare" un campione di riferimento normale, e viene comparato, mediante ibridazione, con migliaia di sonde di riferimento. Le sonde di riferimento sono ottenute  dalla maggior parte dei geni conosciuti e dalle regioni non codificanti del genoma. In caso di non corrispondenza tra il campione da studiare e il campione di riferimento normale, si segnala un'anomalia.

Tecnica: al 5° giorno di sviluppo embrionale viene prelevato con una biopsia microchirurgica un piccolo numero di cellule derivanti dall'abbozzo placentare, dalla parte opposta all'area che darà origine al bambino. Su questa cellule, viene applicata la tecnica array CGH per determinare se i cromosomi hanno un assetto corretto o anomalo.

Il limite della metodica è nel fatto che essa è costosa, e che richiede il raggiungimento dello stadio di blastocisti, che oltretutto deve essere ben espansa, per distinguere correttamente la parte su cui si effettua la biopsia dalla parte da cui deriva il bambino, che non deve essere toccata.

Questo determina un limite intrinseco della metodica: soltanto le blastocisti morfologicamente "belle" vengono studiate, mentre quelle che non sono di buona qualità morfologica (es. non ben espanse), non vengono studiate. Potrebbe essere il caso che una blastocisti inadeguata sul piano morfologica sia sana dal punto di vista cromosomico ma, poichè non viene biopsizzata, di conseguenza non verrà trasferita in utero, mentre una blastocisti molto bella sul piano morfologico potrebbe essere completamente anomala sul piano cromosomico.

Il vantaggio della metodica risiede nel fatto che il mosaicismo sembra limitato, quindi il rischio di errata diagnosi è estremamente basso. Nel nostro Centro, l'accuratezza è superiore al 99,5%. Altro vantaggio è che, applicando correttamente la array CGH, l'analisi si estende a tutti i cromosomi e non soltanto ai 5-12 della FISH.

Uno svantaggio importante è che gli studi controllati su questa metodica sono limitatissimi.

Due sono gli studi controllati:

• nel primo, pubblicato nel 2012 sotto forma di abstract, si dimostra un vantaggio in donne con età superiore ai 35 anni
• nel secondo, si dimostra un vantaggio anche nella popolazione generale, a basso rischio (età inferiore ai 35 anni, nessun aborto precedente). Tuttavia, questo studio ha dei limiti dichiarati dagli stessi autori, e cioè che la biopsia è stata effettuata solo su embrioni a buona morfologia, escludendo dall'analisi embrioni potenzialmente sani, ma con anomala morfologia, tuttavia con il potenziale di impiantare e dare un bambino sano.

E' giusto fare questa indagine sempre, senza indicazione ?

Questo dato è ancora preliminare in letteratura. Esiste un solo lavoro, pubblicato nel 2012, che confronta, in pazienti senza una indicazione (a basso rischio)  la fecondazione in provetta senza diagnosi con lo screening pre-impianto incluso nel ciclo di trattamento ICSI (Yang et al 2012). Il lavoro dimostra:

1. un aumento significativo delle gravidanze cliniche evolutive;
2. non dimostra una riduzione degli aborti.

Il lavoro tuttavia ha molti limiti che elenchiamo qui di seguito:

1. è su una casistica molto piccola di conseguenza tende ad enfatizzare i dati positivi;
2. studia pazienti molto giovani, e con un gran numero di ovociti e di embrioni (popolazione rara in Italia);
3. è pubblicato su una rivista scientifica minore;
4. non utilizza una metodologia corretta per valutare i dati, sul piano statistico.

E' giusto introdurre di routine la metodica in tutti i cicli?

Gruppo Donnamed pensa di no. Non c'è alcuna motivazione scientifica seria per proporre questa analisi integrata in ogni ciclo di fecondazione assistita. Piuttosto occorrerebbe effettuare uno studio approfondito, controllato, per dimostrarne la validità in ogni singola coppia.

Perchè viene proposta questa metodica in coppia normali?

In genere su richiesta delle coppie. Alcuni Centri operano questa metodica in modo integrato in ogni ciclo di fecondazione in vitro.

Offrire questa metodica in modo integrato in ogni ciclo ha però il difetto di indurre le coppie a sottoporsi alla metodica, non validata sul piano scientifico.

Si tratta pertanto di una operazione commerciale, senza basi solide in letteratura.

Bibliografia

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